Возрастные и тканеспецифические особенности перекисного окисления липидов и белков при остром стрессе и введении α-токоферола на разных этапах постнатального онтогенеза



Скачать 403.17 Kb.
страница1/2
Дата26.06.2016
Размер403.17 Kb.
  1   2
На правах рукописи

ЧУМАКОВА АННА СЕРГЕЕВНА

ВОЗРАСТНЫЕ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ ПРИ ОСТРОМ СТРЕССЕ И ВВЕДЕНИИ α-ТОКОФЕРОЛА НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА
Специальность 03.00.13 – физиология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Астрахань – 2009


Работа выполнена на кафедре физиологии и морфологии человека и животных Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет», г. Астрахань
Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Нестеров Юрий Викторович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Клаучек Сергей Всеволодович
доктор биологических наук, профессор Сердюков Василий Гаврилович


Ведущая организация: ГОУ ВПО «Волгоградский государственный университет»

Защита состоится « 26 » июня 2009 года в 12-00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу 414056, г.Астрахань, ул.Татищева, 20а.

Автореферат разослан « » __________ 2009 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Нестеров Ю.В.
Список условных сокращений
АФК – активные формы кислорода

ОМ – окислительная модификация

ОМБ – окислительная модификация белков

ПОЛ – перекисное окисление липидов

ПОБ – перекисное окисление белков

СРО – свободнорадикальное окисление

АКМ – активные кислородные метаболиты

СР – свободные радикалы

СОД – супер оксид дисмутаза

АОС – антиокислительная система

МДА – малоновый диальдегид

ОС – окислительный стресс

ПОС – прооксидантная система

ПОЗ – прооксидантная защита

АОЗ – антиоксидантная защита

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время по-прежнему актуальной для современной биологии и медицины остается проблема стресса и его влияния на различные функциональные системы организма. Стресс рассматривается как способ достижения резистентности организма к действию экстремальных факторов различного генеза (Тигранян Р.А., 1988; Судаков К.В., 1996; Ерохин И.А., 1993). Вместе с тем, стресс может стать фактором, оказывающим повреждающее действие на органы и системы, ведущим к развитию заболеваний (Судаков К.В., 1996; Тигранян Р.А., 1988; Теплый Д.Л., 2008).

Важным проявлением стресс-реакции и адапционной перестройки является совершенствование деятельности регуляторных механизмов, участвующих в поддержании оптимального уровня интенсивности обменных процессов на уровне целостного организма (Федоров Б.М., 1991). При этом, несомненно, должны существовать органоспецифические особенности в осуществлении мобилизации различных механизмов при стрессе и проблема реализации стресс-реакции на уровне отдельных органов и тканей остается актуальной. В частности, малоизученным остается вопрос об изменениях метаболических процессов при развитии стресс-реакции.

Как известно, одним из ведущих повреждающих факторов при стрессе, детерминирующих развитие вторичных изменений органов и тканей, является интенсификация свободнорадикального окисления, которая наряду с этим рассматривается как один из универсальных физиологических процессов – окисление биологических субстратов при действии АФК (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988; Барабой В.А., 1991; Ланкин В.З., 2001; Дубинина Е.Е., 2003). Анализ современной научной литературы позволяет прийти к заключению о том, что значительное количество работ посвящено перекисному окислению липидов (ПОЛ), в том числе стресс-индуцированному, при этом окислительной деструкции белков клеток и тканей уделяется меньшее внимание.

Механизмы и последствия стресс-реакции в организме зависят не только от метаболических возможностей различных тканей, но и от возраста индивидуума. В то же время, возрастной аспект исследования свободнорадикальной деструкции белковых и липидных компонентов тканей, незначительно представленный в литературе, должен дополнить известные к настоящему времени закономерности стресс-реакции на разных этапах онтогенеза и позволит существенно углубить представления о возрастных особенностях механизмов адаптации к экстремальным, стресс-индуцирующим воздействиям.



Цель исследования состояла в изучении возрастных и тканеспецифических особенностей перекисного окисления белков и липидов у крыс разных возрастных групп при остром стрессе и введении природного антиоксиданта альфа-токоферола.

Задачи исследования:

1.Провести сравнительное изучение интенсивности перекисного окисления белков и липидов интактных животных разных возрастных групп и выявить его тканеспецифические особенности в условиях фоновой активности.

2.На модели острого эмоционально-болевого стресса исследовать уровень липидной и белковой пероксидации в мозговой ткани и органах висцеральной системы у неполовозрелых, взрослых и старых крыс.

3.Провести сравнительный анализ выраженности возрастных и стресс-индуцированных изменений свободнорадикального окисления липидов и перекисной деструкции белков.

4.Изучить влияние природного антиоксиданта витамина Е на свободнорадикальное окисление липидных и белковых компонентов различных тканей в условиях фоновой активности, острого стресса и на разных этапах постнатального онтогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Свободнорадикальные процессы в условиях фоновой активности и стресса имеют тканевую специфичность, которая заключается в различной выраженности и направленности перекисного окисления белков и липидов в мозге, печени, легких и миокарде экспериментальных животных.

2. Процессы окислительной модификации белковых и пероксидного окисления липидных компонентов тканей не находятся в тесной зависимости друг от друга.

3. Реакция организма на однократное стрессорное воздействие зависит от возраста животного и отличается динамикой накопления продуктов перекисного окисления белков и липидов.

4. Антиоксидантное и (или) прооксидантное действие природного антиоксиданта α-токоферола зависит от ткани и возраста животного.

Научная новизна. Впервые исследованы и сопоставлены процессы белковой и липидной пероксидации в различных тканях на разных этапах постнатального онтогенеза. В эксперименте выявлены возрастные особенности стрессорной динамики показателей ПОЛ и ПОБ в мозге, печени, легочной ткани и миокарде. Показано, что процессы СРО в этих органах не всегда изменяются однонаправлено у крыс разного возраста в норме и после стрессирования животных.

Получены ранее не известные данные о достаточно высокой силе влияния возрастного фактора на фоновую активность процессов белковой и липидной пероксидации в мозге, легких и миокарде, а также на стрессорную динамику изучаемых параметров. В частности, показано сильное влияние возраста на стрессорный уровень МДА в конечном мозге и легких и ПОБ в миокарде, мозге и печени. В ходе исследования показано также, что предварительное введение α-токоферола приводит к его выраженному антиоксидантному действию в большинстве, но не во всех органах у молодых и половозрелых животных.



Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования демонстрируют наличие возрастных и тканеспецифических различий свободнорадикальных процессов при остром стрессорном воздействии и расширяют представления о механизмах ранней реакции антиоксидантной системы на стресс-индуцирующие воздействия.

Онтогенетические различия в динамике накопления продуктов свободнорадикального окисления липидных и белковых компонентов тканей служат основанием для анализа результатов повреждающего действия эмоционально-болевого стресса в эксперименте и клинической практике. Выявленные эффекты природного антиоксиданта α-токоферола открывают дальнейшие перспективы для его более широкого практического использования в медицине и ветеринарии при профилактике и лечении стрессорных повреждений органов. Материалы диссертационного исследования могут быть включены в курсы лекций по физиологии, экологической физиологии для студентов биологических специальностей университетов.



Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на Международной конференции “Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье населения. Актуальные проблемы биологии и медицины” (Астрахань, 2000), ХХ международном симпозиуме “Эколого-физиологические проблемы адаптации” (Москва, Российский Университет Дружбы Народов, 2001), ХХI международном симпозиуме “Эколого-физиологические проблемы адаптации”(Москва, Российский Университет Дружбы Народов, 2003), Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), VIII Международной научно-практической конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря (Медико-биологические исследования)» (Астрахань, 2007), на итоговых научных конференциях студентов, аспирантов и преподавателей Астраханского государственного университета (2005-2008),.

По материалам диссертационного исследования опубликовано 9 работ.



Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, включающего четыре подглавы, главы материал и методы исследования, двух глав, посвященных результатам исследования и их обсуждению, выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован 8 таблицами и 25 рисунками. Библиографический список включает 321 источников, из которых 184 иностранных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на белых крысах-самцах в трех сериях опытов на 3-х возрастных группах животных: 1 – неполовозрелые 7 недельного возраста массой 64 г; 2 – половозрелые животные 4-х месячного возраста, средней массой 153 г.; 3 – старые животные 18-ти месячного возраста, средней массой 385 г, всего 84 животных. Животные были разделены на следующие группы: 1) интактные животные, 2) животные, подвергавшиеся эмоционально-болевому стрессу, 3) крысы, получавшие масляный раствор α-токоферолацетата в течение 14 дней per os в дозе 1 мг/100 г массы тела, 4) крысы, подвергавшиеся эмоционально-болевому стрессу с предварительном введением α-токоферола в той же дозе. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. По окончании опытов животных декапитировали после предварительной наркотизации крыс внутрибрюшинным введением нембутала в дозе 4 мг/100 г массы тела (Арушанян Э.Б., Толпышев Б.А., 1981). Перед экспериментом животных хендлировали (Жуков Д.А., ВиноградоваЕ.П., 1995; Виноградова Е.П., Чаадаева Е.В., 1994).

Моделью эмоционально-болевого стресса служило электрокожное раздражение, для чего использовали прямоугольную камеру с решетчатым металлическим полом, соединенным с источником переменного тока фиксированного сопротивления, получаемого с помощью лабораторного автотрансформатора. Крысу помещали в установку на 5 мин. для ознакомления с ней, а затем подавали электрический ток с напряжением 40 V на протяжении 15 мин. с интервалами 30 сек. (Буреш Я. И соавт, 1991). Животных забивали сразу после извлечения из камеры. После декапитации забирали кровь, выделяли большие полушария и гипоталамус, вскрывали грудную и брюшную полость и отпрепаровывали легкие, сердце и печень для последующей гомогенизации, экстрагирования тканей и биохимического анализа.

О развитии стресса у животных судили по изменению количества эозинофильных гранулоцитов (проба на эозинопению) и количеству адреналина в крови, а также относительной массе надпочечников (по отношению к массе тела).

Количество эозинофильных гранулоцитов в крови, забираемой из хвостовой вены, оп­ределяли после их окрашивания жидкостью Дунгера в камере Горяева с последующим пересчетом числа эозинофилов в 1 мм3 крови (Ронин В.С., Старобинец Г.М., 1989). Для окрашивания эозинофилов готовили основной раствор (эозин К, вода и 40% формалин) и рабочий раствор (2 части основного рас­твора, 2 части ацетона и 6 частей воды). Во флакон помещали 0,2 мл рабо­чего раствора, пипеткой от гемометра добавляли 0,02 мл крови, взятой из хвостовой вены, перемешивали и заполняли камеру Горяева. Подсчет про­водили через 4 минуты при увеличении по всей поверхности сетки.

Количество адреналина в крови, получаемой после декапитации животных, проводили по методу, основанном на колориметрическом определении интенсивности синего ок­рашивания, возникающего при взаимодействии адреналина с реактивом Фолина (по Филиппович Ю.Б. и соавт., 1975). Для этого к 1 мл плазмы крови добавляли 4 мл свежеприготовленного 10% раствора N2СО3, 0,5 мл реак­тива Фолина и доводили объем пробы раствором N2СО3 до 10 мл. Парал­лельно готовили стандартный раствор адреналина с концентрацией 0,05 мг/1 мл. Экстинцию проб измеряли при λ=700. Расчет проводили по формуле: С х Eоп/Ест., где С - концентрация адреналина в стандартном растворе, Е - экстинция опытной и стандартной проб.

Уровень свободнорадикального окисления определяли по скорости перекисного окисления липидов и перекисного окисления белков (ПОБ) в гомогенатах больших полушарий, гипоталамусе, печени, легких и миокарде.

Для определения перекисного окисления белков использовали методику Дубининой Е.Е., Бурмистрова С.О., Леоновой Н.В. (1995 г.). Для анализа использовали 0,05-0,1 мл экстракта тканей, осаждение белков осуществляли с помощью 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). К денатурированным белкам приливали равный объем (1мл) 0,1 М 2,4-денитрофенилгидразина (2,4-ДФГ), растворенного в 2 М НСL. В контрольную пробу добавляли вместо 2,4-ДФГ равный объем 2 М HCL. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем пробы центрифугировали при 3000 g в течение 15-20 мин. Осадок промывали 3 раза раствором этанол – этилацетат (1:1). Полученный осадок подсушивали с целью устранения оставшегося растворителя этанол — этилацетат и затем растворяли в растворе мочевины. Мочевину приливали к осадку в объеме 2,5 мл и выдерживали в кипящей бане в течение 5 мин до полного растворения. Оптическую плотность образовавшихся денитрофенилгидразонов измеряли при длине волны 540 нМ.

Перекисное окисление липидов в гомогенатах тканей оценивали по скорости спонтанного и неферментативного аскорбатзависимого ПОЛ, содержанию в тканях конечного продукта ПОЛ – малонового диальдегида (МДА).

Метод определения малонового диальдегида и скорости пероксидного окисления липидов в гомогенатах тканей (Строев Е.А., Макарова Е.Г., 1986) основан на определении содержания конечного продукта ПОЛ – малонового диальдегида, который при взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой образует окрашенный в розовый цвет триметиновый комплекс, имеющий максимум поглощения при λ=530-532. Навеску тканей 0,5 г гомогенизировали в 19,5 мл охлажденного 1,2% раствора хлорида калия. В одну пробирку наливали 2 мл гомогената и 0,2 мл дистиллированной воды, во вторую – 2 мл гомогената и по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты (2,6 мМ) и соли Мора (4·10-5) , в третью – те же вещества, что и во вторую и 1 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты. Все пробы помещали на 10 минут в водяную баню при 37ºС, после чего в первые две пробирки прибавляли по 1 мл трихлоруксусной кислоты и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Далее отбирали по 2 мл надосадочной жидкости, добавляли по 1 мл 0,8% раствора тиобарбитуровой кислоты и помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 минут. После этого их охлаждали и измеряли экстинцию на фотоэлектроколориметре при 532 нм. Расчет проводили по формулам:

Х12) = Е12) х 3 х 3,2 х 6 ; Х3 = Е3 х 3 х 3,2

0,156 х 2 0,156

где Х1 – скорость спонтанного ПОЛ (нмоль МДА/0,05 г/ за час инкубации), Х2 – скорость аскорбатзависимого неферментативного ПОЛ (нмоль МДА/0,05 г за час инкубации), Х3 – содержание МДА в исходном гомогенате (нмоль/0,05 г сырого веса ткани); Е – экстинции соответственно 1-й, 2-й и 3-й проб; 3,2 – общий объем исследуемых проб, мл; 2 – объем надосадочной жидкости, взятой на определение МДА, мл; 3 – объем проб, взятой на фотометрию, мл; 0,156 – экстинция 1 нмоль МДА в 1 мл при 532 нм.

Весь экспериментальный материал обрабатывался статистически с вычислением средней арифметической, ошибки средней, достоверности различий по критерию Стьюдента и проведением корреляционного и дисперсионного анализа с вычислением достоверности силы влияния по Фишеру (Плохинский Н.А, 1980; Лакин Г.Ф., 1990).


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С целью подтверждения развития стресса и выявления возрастных различий в стресс-реактивности экспериментальных животных наряду с поведенческими реакциями изучались некоторые физиологические показатели до и после однократного электрокожного раздражения (табл. 1). В ходе эксперимента у половозрелых крыс наблюдалась выраженная реакция на электро-болевое воздействие со стороны крови и дыхания: частота дыхания увеличилась по сравнению с контролем на 73,1% у половозрелых и на 56,1 у старых животных. Причем частое и глубокое дыхание наблюдали у крыс в течение всего периода воздействия (15 минут) и сразу после извлечения крыс из камеры. По эозинопеническому критерию данное воздействие оказалось стресс-реализующим, что выражалось в значительном снижении числа эозинофильных гранулоцитов в крови половозрелых крыс (на 16%). Анализ крови на содержание адреналина выявил значительное его увеличение после стресса - на 34,8% (половозрелые) и на 16,6% (старые). При этом относительная масса надпочеч­ников достоверно не изменялась, хотя тенденция к ее увеличению наблю­далась у крыс этих двух возрастов (на 10,8% и 11,3%) (табл.1).

Реакция неполовозрелых крыс на ЭКР имела свои особенности. Частота дыхательных движений у них при стрессе понижалась (на 21,2%). В отли­чие от выраженной гипервентиляции у взрослых крыс, у крысят наблюда­ли частое поверхностное дыхание, которое сопровождалось периодическими длительными остановками с видимым спазмом брюшной мускулату­ры. Обращает на себя внимание разница в исходных значениях частоты дыхания (у взрослых - 87,4 ± 3,2, у крысят - 124,0 ± 3,9, р<0,01). Можно по­лагать, что гиповентиляционные эффекты и недостаточная реактивность внешнего дыхания к действию стрессора у неполовозрелых крыс связаны с незрелостью дыхательного центра, его меньшей чувствительностью к углекислому газу и, как следствие этого, быстрым функциональным истощением респираторной системы организма (табл.1).

Реакция крови крысят на ЭКР проявилась в выраженной эозинопении (число эозинофилов снизилось на 41 %) и повышением, хотя намного меньшим по сравнению с половозрелыми и старыми, уровня адреналина (на 5,9%). Исходный уровень катехоламина в крови крысят был значительно выше, чем у взрослых животных. При этом отно­сительная масса надпочечников у крысят достоверно не изменялась и даже наблюдалась тенденция к ее снижению.


Таблица 1

Показатели стресс-реактивности животных разных возрастных групп в условиях острого эмоционально-болевого стресса (М±m)

Показатели



Возраст животных

Неполовозрелые

Половозрелые

Старые

Контроль

Стресс

Контроль

Стресс

Контроль

Стресс

Частота дыхания, мин.

124,0±3,9

97,7±8,4

87,4±3,2

151,3±5,1

87,1±4,56

136,0±3,08

Р

<0.01

<0.001

<0.001

Адреналин мг/мл плазмы

0,0776±

0,001


0,0822±

0,001


0,0453±

0,002


0,0611±

0,004


0,0301±

0,0008


0,0351±

0,0001


Р

<0.05

<0.05

<0.001

Эозинофилы, в 13 мм крови

595,0±18,7

351,8±

23,0


513,3±

17,7


431,4±

21,3


185,0±12,5

461,5±17,1

Р

<0.001

<0.02

>0.05

Масса надпочечников, мг/г

0,0953±

0,003


0,0855±

0,004


0,0775±

0,004


0,0859±

0,003


0,0623

±0,005


0,0694±

0,002


Р

>0.5

>0.05

>0.05

Примечание. Р дано в сравнении с контролем.

Повышение уровня катехоламинов в крови при остром стрессе явля­ется неоспоримым фактом (Филаретов А.А, 1987; Пшенникова М.Г. и соавт., 2000). Различные варианты реакции дыхательной системы на шок, по имеющим­ся в литературе данным, сопровождаются определенными изменениями нейрогормональных взаимоотношений. Так, стресс-вызванные гипервен­тиляционные эффекты (при наличии частого и глубокого дыхания) сопро­вождаются повышением функциональной активности симпатоадреналовой, холин- и серотонинергической систем, а стресс-индуцированная гиповентиляция (при наличии асинхронно частого и по­верхностного дыхания) определяется усилением адренергических процес­сов и падением активности систем ацетилхолин-холинэстераза и серотонин-моноамиоксидаза (Базаревич Г. Я., 1973). Наши данные позволяют сделать заключение о развитии стойкой стресс-реакции взрослых крыс в ответ на действие электрического тока, что подтверждается соответствующими изменениями показателей стресс-реактивности, которые сопровождаются адекватной реакцией со стороны внешнего дыхания. У неполовозрелых животных, наряду с выраженной стресс-индуцированной реакцией крови по гормональному и иммунному компонентам, имеют место гиповентиляционные эффекты при изначально высокой исходной частоте дыхания (табл. 1).

При анализе полученных в ходе экспериментов данных у интактных животных разного возраста нами обнаружены как онтогенетические, так и тканеспецифические особенности пероксидного окисления как белковых компонентов тканей так и липидной пероксидации. Так, уровень конечного продукта ПОЛ в гипоталамусе был более высоким у крысят по сравнению с половозрелыми, при этом у старых животных он заметно отличался от уровня МДА у неполовозрелых. В этой области мозга фоновый уровень ПОБ имел одинаковые значения у взрослых и старых (0,016 нмоль/ч), который превышал величину ПОБ у неполовозрелых крыс. Что касается кинетических характеристик ПОЛ, то скорость индуцированного ПОЛ у взрослых и старых крыс был ровно в два раза ниже, чем у крысят. Уровень спонтанного ПОЛ у половозрелых понизился на 13%, а у старых увеличился на 244% по сравнению с крысятами (табл. 2).

При биохимическом анализе ткани больших полушарий мозга возрастных различий в уровне малонового диальдегида обнаружено не было. При этом, кинетические характеристики ПОЛ имели возрастные особенности: спонтанное ПОЛ повышалось у третьей возрастной группы по сравнению с крысятами и половозрелыми, скорость аскорбатзависимого ПОЛ так же у старых в полтора раза превышала его уровень у молодых и взрослых крыс. Такая же тенденция обнаружена нами и в отношении окислительной деструкции белков в конечном мозге животных.

Исследования показали, что в тканях висцеральных органов имела место достоверная разница в уровне МДА у животных разного возраста, что наблюдалось и в случае с ПОБ. Однако необходимо отметить, что более видимые возрастные отличия изучаемых параметров у интактных животных имели место в легочной ткани для ПОЛ и в легких и миокарде для ПОБ (табл.2).

Далее одной из задач исследования было изучение стресс-чувствительности различных органов крыс разных возрастных групп в отношении свободнорадикального окисления.



На модели острого электрокожного раздражения обнаружены разнонаправленные изменения уровня ПОЛ в различных тканях, причем это касалось как концентрации в гомогенатах тканей МДА, так и кинетических характеристик ПОЛ.

  1   2


База данных защищена авторским правом ©refedu.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница